紫外可见分光光度计测量原理

      紫外可见分光光度计的原理是利用物质的分子或离子对某一波长范围的光的吸收作用，对物质进行定性分析，定量分析及结构分析，所依据的光谱是分子或离子吸收入射光中的特定波长的光而产生的吸收光谱。根据所吸收光的波长区不同，分为紫外分光光度法和可见光光度法，合称为紫外可见分光光度法。

      紫外可见分光光度法是研究物质在紫外可见光波下的分子吸收光谱的分析方法，在光的性质中200-400nm波长的光叫做紫外（UV），从400-800nm叫做可见（VIS），从800nm到近1毫米是红外（IR）。仅可见光才能被我们的眼睛看见，而包含所有波长的光，包括紫外，可见光和红外叫做白光（例如太阳光），太阳光发出的白光可以通过棱镜滤光片等分成七种类似彩虹的颜色，白光即包含所有波长的光，单色光即单波长的光。

      根据朗伯比尔定律：A＝kbc表明：一定温度下，一定波长的单色光通过均匀的、非散射的溶液时，溶液的吸光度与溶液的浓度和液层厚度的乘积成正比。

      A＝kbc式中:

      A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；

      k：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；

      b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；

      c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１；

      我们可以举个小例子来说明一下，有甲乙两个相同材质的玻璃杯，其中甲装有洁净的水而乙装的是浑浊的水把它们放在靠窗的地方，这时甲可以透过大部分的光，而乙则没有那么多光透过，在这里透过的光的比率称为透射比，透射比通常以百分比形式来表示（%T）相反的从窗口透过的的光被吸收比率*叫做吸收率（Abs）。

      物质对光的吸收是选择性的，利用被测物质对某波长的光的吸收来了解物质的特性，通过测定被测物质对不同光的吸收强度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标即可得出该物质在测定波长范围的吸收曲线。在吸收曲线中，通常选用*大吸收波长进行物质含量的测定。例如苹果是红色的，为什么苹果看上去是红色的而不是别的颜色？*好比我们对某种颜色喜欢一样，物质对颜色也有偏好，当某种物质暴漏包含各种颜色的光中时，它吸收并仅保存了光中它*喜欢的颜色，它不喜欢的颜色被反射，这*形成了我们眼中看到的某种物质的颜色。

      根据这一特性我们即可通过颜色密度来对物质进行定量分析以此来测定某种物质（溶液）的含量，例如我想测自来水里的铁，通常无法直接采用分光光度法进行测量，因此在这种方式测定中需要添加与目标物质反应显色的着色试剂，里面含铁越多则颜色*越深（高吸光度）少则相反。这时我们需要配置标准溶液的校正曲线，从低到高来测量标准浓度的吸光值获得该测量的校正曲线。在定量分析中还要考虑物质的吸收波长，通过观察测量已经着色的吸收光谱来选择吸收*大而相对平滑的波长（现在多数仪器已能自动测量物质的*佳吸光率如HACH的DR3900）。

      实际测量时光谱与测定条件也有密切的关系，测定条件如温度，溶剂极性等不同，吸收光谱的形状、吸收峰的位置、吸收强度等都可能发生变化。对于溶剂的选择要注意尽量选用低极性溶剂同时能很好的溶解被测物，并形成溶液具有良好的化学性质和光化学的稳定性，溶剂在样品的吸收光谱区无明显的吸收并注意保证实践条件的一致性，这样既能保证*小误差又可达到*佳的测量结果。

紫外可见分光光度计的机理：

      尽管我们可以通过感知物质的颜色来预测总的吸收波长，但无法进行*的波长分析，而且还可能存在着个体差异，另外人眼也无法观测到紫外线区。而在紫外可见分光光度计的系统中不存在个体的差异，原因是在分光光度计中使用人造光源来代替白光，光不是直接照射在物体上的，而是通过棱镜或衍射光栅将白光分成许多颜色，然后每种颜色（单色光）分别扫描物体来测量物质的吸收波长。

紫外可见分光光度计的基本构造：

      分光光度计主要由光源、单色器（分光镜）、吸收池、检测器和显示器五大部分组成。

      光源：在整个紫外光区或可见光区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命，可见光区常用的光源是钨灯或碘钨灯，波长范围是350-1000nm。在紫外区常为氢灯或氘灯，发射的连续波长范围是180-360nm。

      单色器：是将光源辐射的复合光分成单色光的光学装置。它是分光光度计的心脏部分。单色器一般由狭缝、色散元件及透镜系统组成。关键是色散元件，*常见的色散元件是棱镜和光栅。

      •狭缝：将单色器的散射光切割成单色光。直接关系到仪器的分辨率。狭缝越小，光的单色性越好。分为入射狭缝和出射狭缝。

      •棱镜：175-2700nm的光能被分开，色散随波长变化，波长长色散差，材质主要有水晶和溶凝石英。

      •光栅：色散在整个波长范围内是统一的。1个衍射光栅能获得宽波长。另外，用常量狭缝宽度能获得常量光谱。因此具有波长范围宽，色散均匀，分辨性能好，使用方便的优点。

      样品池：用于盛装试液的装置。吸收材料必须能够透过所测光谱范围的光。一般可见光区使用玻璃吸收池，紫外光区使用较贵的石英吸收池。测量时要挑选配对，因为吸收池材料的本身吸光特性以及吸收池的光程长度的精度等参数对分析结果都有影响。

      检测器：用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电管、光电倍增管、光电二极管、光电摄像管等。它的作用是充当在紫外和可见区有灵敏性的光电管和放大器的作用。要求灵敏度高、响应时间短、噪声水平低、稳定性好等性质。

      显示器：将检测到的信号输出显示出来，能直观的对结果进行观看分析。

分光光度计的分类：

      一般有可见分光光度计，紫外分光光度计，可见紫外分光光度计，红外分光光度计等。按仪器使用的光学系统还分为单光束、双光束、多波长光度计等。

单光束：经单色器分光后的一束平行光，轮流通过参比溶液和样品溶液，以进行吸光度的测定。这种光度计的特点是简单便宜适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。

      双光束：经单色器分光后经反射镜分解为强度相等的两束光，一束通过参比池，一束通过样品池。光度计能自动比较两束光的强度，此比值即为试样的透射比，经对数变换将它转换成吸光度并作为波长的函数记录下来。一般具备快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。此种仪器操作复杂价格较高。

      双波长：由同一光源发出的光被分成两束，分别经过两个单色器，得到两束不同波长的单色光；通过折波器以一定的频率交替通过同一样品池，然后由检测器交替接收信号，*后由显示器显示出两个波长处的吸光度差值从而扣除了背景吸收的吸光度，达到更*的测量效果。