植物叶绿素的测定

       叶绿素（chlorophyll）是一类与光合作用（photosynthesis）有关的*重要的色素。光合作用是通过合成一些有机化合物将光能转变为化学能的过程。叶绿素实际上存在于所有能进行光合作用的生物体中，包括绿色植物、原核的蓝绿藻（蓝菌）和真核的藻类。叶绿素从光中吸收能量，然后能量被用来将二氧化碳转变为碳水化合物。与植物的生长情况和能量的积累密切相关。

       另外叶绿素含量的多少对植物源食品的色泽也有重要的影响，例如绿茶的外形色泽*与叶绿素含量有密切的关系。叶绿素在植物细胞中与蛋白质结合成叶绿体，当细胞死亡后，叶绿体即被解离，随之叶绿素游离出来。游离的叶绿素很不稳定，对光、热都较敏感，在酸性条件下很快生成褐色的脱镁叶绿素，加热可使该反应加速。但在弱碱性条件下叶绿素会被水解为叶绿酸盐、叶绿醇及甲醇。

       叶绿素的测定一般使用分光光度法，需要将植物研磨成液体，再进行分析。其原理如下：     高等植物体内叶绿素有a，b两种，二者都易溶于乙醇、乙醚、丙酮和氯仿。叶绿素a，b分别对663nm和645nm波长的光有*大吸收，且两吸收曲线相交于652nm处。因此，将植物中叶绿素经适当提取，然后在645nm、663nm和652nm处测其光吸收值，*可求得叶绿素含量。

       具体测试方法和计算公式如下：

       •均匀称取植物样品5g于研钵中，加入少许石英砂（约0.5～1g）和冷丙酮充分研磨后倒入100ml容量瓶中，然后用丙酮分次洗涤研钵并倒入容量瓶中，*后用丙酮定容至100ml。

       •充分振摇后用滤纸过滤。取滤液分别在645nm、652nm和663nm处测其光吸收值。以95%的丙酮作空白。

       上述方法实验步骤繁琐，不适合现场快速测量，只能用于实验室研究。为了解决困扰现场测试人员遇到的难题。近些年逐渐出现了一些便携式叶绿素测量仪，其中CCM-300测量*为稳定*。这些仪器能够快速测量植物的叶绿素含量，为现场快速评估提供了选择。

       Gitelson等（1999）比较了多个荧光激发波长和发射波长与叶绿含量的相关性，他们发现，使用多种激发波长和较窄范围的红外与远红外发射荧光具有较好的结果。当将荧光的发射峰从685nm移动到700nm时，被叶绿素的重吸收和再发射的额外荧光被降至*低。

       CCM-300使用了460nm的二极管（蓝光），可轻微的透过叶片，因此叶绿素对发射荧光的重吸收和再发射不再是一个问题。相较于传统的吸收法测量设备，这些改变能够测量更大范围的叶绿素含量（42 mg/m2~675mg/m2）。因为较长的激发光能够到达叶片深处，导致更高的重吸收，CCM-300使用460nm激发光，绝大多数荧光来自于叶肉细胞，并且重新释放的荧光被将至*低（Bushman et al.,2007）。

       CCM-300从设计上将Kautsky诱导效应降至*低。即使样品光适应或者暗适应20分钟，测量结果也几乎不受影响。Bushmann(2007)的研究结果表明，其他波长的荧光比率和方法则受该效应影响显著。与CCM-300使用的F735/F700比值不同，Bushman(2007)发现，在光合作用达到*大和暴露在光下时，690/F735的发射荧光比值表现出强烈的Kautsky诱导效应。他还发现，在Kautsky诱导效应过程中，较短的发射荧光波长较波长较长的荧光变化较快，也可通过使用光强很低的调制光源降低该效应。

       Buschmann的研究中使用了F690/F735比值与叶绿素含量的关系，在温度从23℃降至4℃时，该比值可下降25%。这是由于状态转换和PSI荧光引起的。而当使用CCM-300测量美国五针松时（温度从20℃降至3℃），F735/F700仅从1.72降至1.68。

       上述结果表明，CCM-300很好的克服了叶绿素荧光的变量给测量带来的困难，是*、可靠测量叶片叶绿素含量的仪器。